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　　免费在线章 色谱柱 色谱柱的构造： 柱管、压帽/卡套、筛板（滤片）、接头 分析型 常规分析柱（4.0/3.9mm、4.6mm） 窄径柱（1.0mm、2.1mm） 毛细管柱（0.2-0.5mm） 制备型 半制备柱（〉5mm，7.8mm、9.8mm、10mm） 制备柱（21.2mm、30mm、50mm） 柱填料 3-1-1柱填料 一 硅胶微粒 硅胶微粒是当前使用最多的HPLC填料. 优点:物理性质优秀; 机械强度高；反压较低，柱寿命长；柱效最高；表面化学性质理想，不溶涨。 粒度(10、5、3um)；孔径变化范围宽（8、30、100）；孔径分布范围窄。 硅胶微粒 缺点： PH值限制 2-8或2-9 硅胶填料的纯度、比表面积与孔径大小、表面化学性质不同，其具有的色谱性质不同。下面我们简单的讨论以下三个问题。 ①表面积与孔径大小 全多孔硅胶的制备工艺： 硅溶胶与甲醛和尿素加在一起，酸性介质中搅拌，发生聚合反应，得到的聚合物，高温灼烧（700℃）除去尿素与甲醛聚合物，可以得到粒度分布范围窄的二氧化硅小球。（硅溶胶法） 具备 粒度小且均匀；机械强度好；孔径大小可控；寿命长等优点。（图5-1） ①表面积与孔径大小 从保留的角度讲：对同一溶质，硅胶的表面积越大，保留值越大。比表面积可以从100m2/g---860m2/g。孔径与比表面积有相反的趋势，即孔径小，比表面积大；孔径大比表面积小。 从分离的角度讲：适宜的孔径尺寸可使样品分子进到填料微粒的内部，同时样品分子在空腔内扩散相对较快。要求孔径直径比样品分子直径至少大3倍。分离小分子物质通常用70—150A孔径；分离大分子物质通常用300A孔径。 ②表面化学性质（图5-3） 经800℃以上高温后，硅醇基大部分脱掉在HPLC上无价值。 硅胶表面完全羟基化，理想状态 自由型（非键合型）硅醇基，酸性较大可使一些碱性物质拖尾 双基型（氢键键合型） 将传统纯度不高的酸性硅胶称为“A型硅胶”；将纯化的弱酸性的硅胶称为“B型硅胶”。见下面的例子（图5--4） ③高纯硅胶 硅胶填料在制造过程中会含有少量金属离子杂质 现在各公司都在推广一种高纯硅胶，高纯硅胶是除去了大部分表面金属离子的硅胶。 二 多孔聚合物 二乙烯基苯+苯乙烯制成聚苯乙烯 异丁烯酸和乙烯醇制成聚乙烯醇 可以用做反相色谱的分离填料，或离子交换固定相的担体。 缺点：柱效低，分离慢。 柱效不到类似硅胶柱的一半。 优点：使用的PH范围宽1---13 三 其它无机填料 石墨碳 不需要表面键合既可用于反相色谱分离；用于分离C18键合相上保留太小的化合物，及其一些异构体的分离。易碎裂，柱效低，杂质污染不可逆 氧化铝 优点PH值可达12， 氧化锆 PH1—14，聚合物涂层的多孔氧化锆微球。 四 聚合物涂层硅胶 资生堂划时代的专利产品: 包被了silicon polymer薄膜的capsule(胶囊)型充填剂 兼有 silica gel型充填剂的分离性优势 和 polymer 型充填剂的在现性优势onventional ODS polymer薄膜象一层胶囊一样,将酸性硅醇基和金属杂质的影响减小到极限。 耐碱性的polymer薄膜扩展了适用范围( pH 2-10), 延长了柱寿命,令使用更灵活。 低柱压,可进行快速分离。 卓越的选择性 有不同等级和多样品种可供选择。 polymer薄膜和官能基化学修饰是优异的重现性的最佳保证。 提供GLP/GMP 支持 (UG, MG) ? CAPCELL PAK柱消除了由溶质与痕量金属杂质和硅醇基相互作用而造成的峰拖尾,从而具有卓越的耐用性和重现性。 与一般的ODS不同, CAPCELL PAK柱采用了两步合成: 1)通过气相沉积作用(CVC法)在超纯硅胶表面包被一层均匀致密的silicon polymer薄膜, 2) 在polymer薄膜之上键合不同官能基,从而遮挡残留的酸性硅醇基 (Fig.1)。这种独特的设计既增加了机械强度又扩大了PH安定性，同时,为改善酸性,中性和碱性化合物的峰形提供了保证。CAPCELL PAK结合了硅胶柱和polymer column的优势, 因而具有优异的分离效率和化学安定性 (Table 1)。 五、碳杂化硅胶 小结： 柱填料的种类 1硅胶 全多孔 高纯 涂层 杂化 2有机聚合物 3其他 3-1-2色谱柱 不锈钢柱： 柱体（内部高度抛光不锈钢、） 滤片（不锈钢、多孔钛、聚合物） 接头 玻璃柱 玻璃内衬柱 聚合物外壳柱（径向加压柱） 卡套柱：两端未装接头的空管坯+重复使用的柱架和接头。（价格较低） 色谱柱 内径0.3—0.46cm（表5-5） 填料的粒度3-10μΜ. 内径0.3cm的色谱柱比0.46cm的柱节约一半的溶剂,0.21cm内径节约3/4 问题是柱外效应变的更重要，细内径柱一般不易填充均匀。 0.35μm填料和0.30cm内径的柱子可能会更流行。 3-2-固定相一 键合硅胶 化学键合相：将固定液通过化学反应键合在基质表面构成的色谱填料。 （图5-7）（图5-8） 图5-7显示的是应用最多的表面反应式 图5-8显示C18键和相的种类 a 表面硅醇基与氯二甲基硅烷反应 称为“单体”“Monomeric”键合相，特点是重现性好，柱效较高 b与三氯硅烷反应 c与三官能团烷基硅烷反应 b、c 称为“多体”“Polymeric”键合相，特点是对低PH较稳定，但重现性较差。C还用于引入氨基等极性基团。 二 化学键合相常用性能指标 形状/粒度 s(spher) 5um 孔径(A) 100(60--300) 孔体积(ml/g) 1.0ml/g 比表面积(m2/g) 350(100---860) 碳(键)含量% （carbon load ） 14% monomeric 25 % polymeric 表面覆盖率(umol/m2) 2.7(1.9—4.1) 端基封尾 end capping 化学键合相常用性能指标 形状、粒度、孔径、比表面积前面已经讨论过。 应用的化学反应：参考图5-7，5-8 化学键合相常用性能指标 单体键合相已广泛商品化，二甲基取代或二异丙基取代对硅氧键（si-o）有某种保护作用。 厂家试图使硅胶表面与硅烷完全的进行反应，但是由于键合相基团的空间位阻效应，表面的硅醇基不能完全参加反应，随着链长和体积的增加，参加反应的硅醇基比例相应减小。表面覆盖率（μmol/m2）是化学键合相的一项重要指标,参考表5—6. 化学键合相常用性能指标 端基封尾:一般是在键合反应结束后,用三甲基氯硅烷(TMCS)等小分子硅烷进行后续处理,以尽量减少表面残存硅羟基. 端基封尾的作用:1 减少残存硅醇基的“次级作用”;硅醇基与极性较大或含有羟基的化合物作用,使色谱峰拖尾.2 减少硅胶基质色谱柱在较高PH下的降解. 目前采用硅溶胶工艺,完全键合和端基封尾制得的C18柱可用于PH值1—11。 二 保留值与选择性变化的原因 官能团（C18、C8等）不同，保留和选择性质肯定不同。 官能团相同时，下列性质可引起保留和选择性质的变化： 1硅胶担体不同 2硅烷的类型：monomeric、polymeric 3表面覆盖率或碳载率 4是否端基封尾 5键合化学：保护基的种类，反应条件 6担体表面积 保留值与选择性变化的原因 总的概念：由于以上多种因素都会影响固定相的保留和选择特性，不同实验者（不同品牌的色谱柱，同一品牌的不同型号，相同型号的不同批次）之间有差异是很正常的。如zorbax ODS、 zorbax Rx-C18、 zorbax SB-C18、 zorbax XDB 下面参考表（5-8） HPLC中有用的柱填料 3-3色谱柱的性能指标 色谱柱的有关要求包括： 1塔板数（N） 2峰不对称因子（As） 3对两种溶质的选择性（α） 4色谱柱的反压 5保留值的重现性 6色谱柱的稳定性 一 塔板数 色谱柱的塔板数N为色谱柱最为重要的特性 N=5.54(tR/w 1/2)2 新柱子都有测定柱效N的报告及条件,刚收到的柱子应重复这样的实验,并记录. 塔板数一种理想情况下的估计值可用下式计算 N=3500L(cm)/dp(um) L为柱长, dp为微粒直径. 理论上,微粒直径越小柱效越高,但目前的情况是微粒直径小于3um时结果并不好.目前10 um、5um、3.5um较为常用. 二峰不对称性与拖尾 峰的对称性在建立方法时是十分重要. 峰的对称性用峰不对称性因子(As)或拖尾因子 (PTF)衡量.(图5--19) As是10%峰高处测量. As= B/A. 理想的色谱峰As在0.95-1.1,一般应小于1.5 PTF是5%峰高处测量. PTF=(A+B)/2A 三 压力降 同一支色谱柱的渗透性（压力降）或反压力应该相似。 用球形微粒填充的色谱柱的压力降可用下式估算： P=3000Lη/（t0dp2） 式中P为压力（psi），L为柱长（cm），为流动相粘度（cp），t0为死时间，dp为微粒的直径。 新的色谱柱使用纯溶剂（甲醇、乙氰）冲洗时要记录压力，这是色谱柱很重要的指标 四 色谱柱失效 一般认为塔板数下降50%,或者分离度下降至原值的3/4,或峰不对称因子增大至1.5以上时,或者柱压力过高时,要考虑更换色谱柱. 对于“干净”的样品,每支色谱柱的分析次数为1000—2000次. 在更换色谱柱和选择好的净化方法之间要有一个比较. 3-4 色谱柱问题的解决方案 在建立HPLC方法时三种重要的问题 1保留值与分离度发生变化；2谱峰拖尾；3色谱柱寿命短 （一）保留值的重现性是建立良好HPLC方法的重要问题。解决的建议如下： 与色谱柱有关：1 开始时选一支好的色谱柱，硅胶基质酸性弱，纯度高，整个应用中都使用同一固定相、粒度及柱尺寸。2 预先保存色谱柱，或联系能连续提供同种柱的公司。 用良好的流动相条件，包括PH、缓冲溶液种类及浓度、添加剂，尽量减小硅胶基质的“次级作用”。 流动相的配制方法：20mMol磷酸钠缓冲液：HCN（9：1）9体积的磷酸钠缓冲液加1体积的HCN溶液混合。脱气方法应一致 缓冲溶液的配制方法：天平定量称量，定容到一定体积最准。如需控制PH值时应使用酸度计，添加好的酸碱。 色谱柱的冲洗和预平衡： 常用添加剂 酸：醋酸，磷酸，三氟乙酸（用于酸性化合物） 胺：三乙胺（用于碱性化合物） 醋酸胺（用于酸性化合物） 醋酸、三乙胺（复杂化合物） 柱温应仔细的控制：使用柱温箱 仪器故障引起流动相流速变化：一定时间内检测流量 （二）谱峰拖尾 拖尾影响 分离的质量，定量的精密度和准确度。 产生拖尾峰的原因： 色谱柱不好，筛板堵塞或柱头有凹陷 “污物”在柱进口处积聚 样品超载 样品的溶剂不对 柱外效应 化学或硅醇基的“二次效应” 缓冲不足或缓冲液不合适 重金属污染 正常使用前后色谱柱要强溶剂冲洗 参考图5-23，5-24 “污物”在柱进口处积聚，柱压高等问题，用纯溶剂（甲醇、乙腈）正冲，反冲。当柱子过“脏”时，正相柱可用甲醇（可加少量水）；反相柱可用异丙醇加甲醇冲洗；96%二氯甲烷+4%甲醇+1%氢氧化铵20倍柱体积25cm的柱子大约50ml （三）色谱柱寿命 色谱柱将失效的一些“症状”： 1色谱柱反压增高 2谱峰拖尾 3塔板数下降 4选择性下降 5保留值减小 引起色谱柱失效的几个原因： 1进口滤片或柱床部分堵塞 2吸附有样品杂质 3柱填充不良 4机械及热冲击造成空洞 5担体或固定相遭受“化学侵蚀” 保证良好柱寿命与性能的方法 表5-14 * * Conventional ODS silica gel packing material Spherical silica gel ODS silica gel CAPCELL C18 Polymer coated packing material Fig.1 1) 2) ? silica gel type capsule type polymer type 耐压性 ○ (20MPa) ○ (20MPa) × (3.5-7MPa) 耐碱性 △ (pH2-7) ○ (pH2-10) ◎ (pH1-12) 分离性 ○ ◎ △ 产品认证 ○ ◎ × *